Genska terapija

Genska terapija obuhvata niz in vivo, ex vivo i in vitro metoda i postupaka za prekomponiranje postojećih i unošenje funkcionalnih kopija gena, koji zamjenjuju ili nadopunjuju (ne)aktivnost alelnih varijanti koje su odgovorne za mnoge bolesti.

Već općepoznati nazivi kao što su: genetičko inženjerstvo, genska manipulacija, gensko kloniranje, tehnologija rekombinantne DNK, DNK kloniranje, genetička modifikacija, molekulsko kloniranje, gensko inženjerstvo, pa i “nova genetika”, opisuju istoznačne pojmove u oblasti biotehnologije na bazi genetičkog inženjerstva. Svi se odnose na istovjetan proces: svrsishodni prijenos ciljanih djelića i molekula DNK iz jednog organizma u samoreplicirajuće genetičke strukture drugog, tj. transgenezu. Takvi transgeni dijelovi DNK se kasnije mogu u potrebnoj količini kopija propagirati u “stranoj ćeliji domaćinu”. Pored genetičkog inženjerstva na molekulskoj razini, već su odavno u primjeni i manipulacije većim kompleksima genetičkog materijala – hromosomima i kompletnim genomima (označene kao hromosomsko i genomsko inženjerstvo).^[2][3][4]

Osnovne komponente strategije molekulsko–genetičkog inženjerstva su:

• isijecanje, mijenjanje i ugradnja DNK molekula in vitro,
• prijenos i predstavljanje isječenih segmenata donorske DNK (gena) u recipijenta – putem odgovarajućih vektora,
• razvoj rekombinovanih DNK molekula u domaćinu putem vektor sistema (koji omogućuje kloniranje rekombinantnih DNK molekula) i
• izbor odgovarajućih DNK sekvenci.

Razvoj tehnologije rekombinatne DNK omogućuje neslućene oblike primjene novih terapijskih metoda, naročito u oblasti genske terapije i transplantacije. Tako se u istraživačke svrhe već se primjenjuje terapeutsko embrionalno kloniranje, koje predstavlja proces izgradnje genetički izmijenjenih ljudskih ćelija i tkiva. Polazni cilj razvoja ovog procesa nije kloniranje integralnih ljudskih organizama, nego “uzgajanje” stem (matičnih, neizdiferenciranih) ćelija koje se mogu koristiti za razvoj terapeutskih programa u novim pristupima kod liječenja oboljenja. Stem ćelije su veoma bitne za biomedicinska istraživanja, jer mogu proizvesti gotovo sve naknadno specijalizirane ćelije u ljudskom organizmu. Izdvajaju se nakon pet dana od iniciranja diobe – u fazi blastocita. Prilikom izdvajanja dolazi do razaranja embriona, što sve češće postaje tema pravnih, etičkih i drugih rasprava.

Ovakva genska terapija je moguća prilikom liječenja određenih genetičkih kontroliranih poremećaja uvođenjem vektora koji “unose” izmijenjene kopije “pogrešnih” gena u ćelije domaćina. Tehnologija terapeutskog kloniranja se u budućnosti može koristiti i kao izvor cijelih organa iz ćelija ili za proizvodnju zdravih ćelija. One mogu zamijeniti defektne ćelije u nekim degerativnim poremećajima, liječenju srčanih oboljenja, kancera, Alzheimerove i drugih bolesti.

Vektori u genskoj terapiji mogu biti virusnog i nevirusnog porijekla. Najčešći i najprikladniji virusni vektori su retrovirusi, adenovirusi, adeno–asocirani i herpes virusi, a od neviralnih – liposomi, lipopleksi i "gola" DNK. Liposomi su mikroskopski sitni mjehurići koji nastaju spontano kada se lipoproteini rasprše u tečnosti. U lipidne micele se mogu inkapsulirati molekule DNK (gen), a lipopleksi su mnogo razvijenije – virusolike stukture. Direktna upotreba "gole" DNK primjenjuje se samo u nekim slučajevima, jer je nedovoljno učinkovita.^[4]

Mikroinjektiranje, biolistika, elektroporacija i infuzija su novije tehnike genske terapije, koje nadopunjuju ili mijenjaju primjenu pomenutih nevirusnih vektora. Direktno ubrizgavanje DNK u tkivo primaoca obavlja se putem posebnih igala. Drugi metod takve procedure je tehnika specifičnog bombardovanja mikroprojektilima (biolistika). Vrlo mali dijelovi (4 μm) načinjeni od zlata ili volframa se oblože (inkapsuliraju) molekulama DNK i posebnim pištoljem (uz veliku početnu brzinu) "upucavaju" u ćelije ili tkiva. Metalne partikule (mikroprojektili) prodiru kroz ćelijski zid i membranu i ne oštećuju ih, a pri tom nastaju pore koje su dovoljnih dimenzija za ulazak strane DNK u unutrašnjost ciljane ćelije. Ovim putem se uspješno mijenjaju više biljke, alge, gljive i prokarioti, uključujući i promjenu hloroplasta i mitohondrija. Ovaj metod intervencije in vivo obećava nove mogućnosti primjene i u genskoj terapiji.

Elektroporacija se uspješno koristi kod mijenjanja mikroorganizama i biljaka, a sastoji se od toga da se silama električnog polja otvaraju pore na ćelijskoj membrani, kroz koje strana DNK može ući u citosol. Zatim se izmijenjene stanice podvrgavaju odabiru (na hranljivoj podlozi), gdje se dijele samo one koje su primile stranu DNK, dok ostale ugibaju. U aplikaciji ovog metoda najčešće se tretiraju protoplasti, kalus i zreli embrioni. Očekuje se da bi ova tehnika mogla biti uspješna i u specifičnim zahvatima genske terapije. Receptor–medijacijska endocitoza je relativno jednostavsn metod infuzijskog prijenosa, koji podrazumijeva da se DNK objedini sa ciljanom molekulom, koja se može vezati na površini posebnog ćelijskog primaoca. Taj kompleks zatim inducira endocitozu i unosi izmijenjenu ćeliju.^[4]

Svaka identifikacija i karakterizacija genetičkih oštećenja otvara logično pitanje mogućnosti tretmana pogođenih pacijenata. Ako se oštećeni gen može transgeno zamijeniti funkcionalnom kopijom koja nema oštećenja, takva bolest se može uspješno spriječiti i liječiti. Taj pristup se označava kao genska terapija i jedan je od iznimno obećavajućih aspekata u primjeni genske tehnologije u medicini.

Genska terapija obuhvata sve oblike sprečavanja i liječenja bolesti kod kojih se pacijentu unose normalni geni koji ispravljaju neispravnosti kod mutantnih gena – odgovornih za određene bolesti. Može se primijeniti raspoloživim in vivo ili ex vivo metodima. U toj oblasti postoje dva glavna moguća pristupa:

• primjena izmijenjenih gena u somatskim ćelijama inficiranog tkiva i
• unošenje takvih gena u reproduktivne (germinalne, germ) linije ćelija.

Ovi pristupi u genskoj terapiji mogu da imaju razne etičke posljedice. Većina naučnika i doktora somatsku gensku terapiju smatra prihvatljivom u mjeri koja (u moralnom pogledu) nije problematičnija od primjene bilo kojeg klasičnog lijeka. Međutim, kada je riječ o genskoj terapiji u liniji germinativnih ćelija, ona je neprihvatljiva za većinu stručnjaka i šire javnosti i zbog rizika narušavanja evolucijske ravnoteže u genskom fondu populacije i ljudske vrste uopće.

Uspješnost odabranog protokola genske terapije uglavnom zavisi o ostvarenju nekoliko glavnih preduslova.

• Gensko oštećenje mora biti uočeno, a raspoloživi gen kloniran u obliku koji je primjenljiv u namjenskim kliničkim programima.
• Neophodno je osigurati raspoloživ sistem primjene gena u ciljno tkivo pacijenta – unošenjem DNK sekvence (putem odgovarajućeg vektora) u ciljane ćelije.
• Nezaobilazan je i pogodan mehanizam pristupa ciljnom tkivu ili organu bilo udisanjem, putem injekcije ili neke druge slične metode.
• Ako su prethodni uslovi ispunjeni, (tj. struktura nefunkcionalnog gena izmijenjena) u ciljnoj ćeliji će se ispoljiti struktura unešenog gena.

U idealnim okolnostima, oštećeni gen bi bilo moguće zamijeniti funkcionalnom kopijom. Takva gensko–zamjenska terapija je jednaka rekombinaciji između oštećene i unesene kopije. Alternativa joj je primjena gensko–adicijske terapije, kojoj nisu potrebni uslovi srazmjerne zamjene genskih sekvenci, jer se funkcije unosnog gena samo pridružuju učincima oštećenog. Ovakav pristup je djelotvoran samo pod uslovom da oštećeni gen nije dominantan, jer u tom slučaju on kodira oštećeni protein koji prekriva svaki efekat unesenog recesivnog transgena. Terapija dominantnog gena se može izvesti upotrebom antisens iRNK (tako da reverzna kopija gena proizvodi antisens konfiguraciju iRNK).

Komplikacije mogu nastati zbog ciljnih ćelija i tkiva. U nekim situacijama je moguće izdvojiti ćelije iz pacijenta i manipulirati njima van tijela, a zatim se oštećene ćelije pacijenta zamijene funkcionalno obnovljenim u ex vivo tretmanu. Ova metoda je pogodna za gensku terapiju bolesti krvnog sistema, ali ne i za liječenje solidnih tkiva, kao što su plućna, pankreasna, koštana i druga – gdje se primjenjuje metoda in vivo.

Genska terapija in vivo počiva na unošenju terapeutskih gena u organizam pacijenta putem mogućih prenosnih–sistema: virusa, kultura ćelija ili drugih sintetičkih vektora unesenog gena. Liposomi sa genima za kontrolu cistične fibroze se u ljudski organizam mogu unijeti sprej–tehnikom inhalacije (u nozdrve). Retrovirusi u koje su ugrađeni antikancerski geni su ubrizgani direktno u maligni tumor uz očekivanje kurativnih efekata. U tim pokušajima već su zabilježeni primjeri uspješnih intervencija. Također se očekuje da bi genska terapija in vivo mogla biti uspješna i u tretmanu hemofilije, dijabetesa, Parkinsonove bolesti ili AIDS–a. U slučaju hemofilije, u organizam pacijenta se unose regularne ćelije sa normalnim genom za proizvodnju koagulacijskih faktora. Takve ćelije se mugu ubrizgati i u organoide, tj. vještačke organe koji se usađujju u organizam pacijenta. Za liječenje Parkinsonove bolesti neophodne su ćelije koje proizvode dopamin u svrhu njihovog direktnog unosa u mozak. U novije vrijeme istražuju se mogućnosti direktnog mijenjanja oštećene DNK sekvence pacijenta sa nasljednom bolešću.

Izbor metoda genskog prenosa ovisi o prirodi ciljanog tkiva i metoda primjene: posredstvom ćelija u kulturi (ex vivo) ili direktno u ćelije pacijenta (in vivo). U principu, nijedan od sistema genskog transfera nije idelan niti univerzalan, jer svaki od njih ima posebne mane i ograničenja.

Genska terapija ex vivo uključuje sve oblike genetičke transformacije molekula, ćelija ili organa u vantjelesnim uslovima i unošenja tako izmijenjenih proizvoda u organizam pacijenta. Još prije desetak godina (1993.) je potvrđena njena opravdanost i učinkovitost Široko i detaljno je opisivan primjer takvog liječenja kompleksne imunodeficijencije (SCID) kod jedne djevojčice (Cindy Cutshall). Ovakva genska terapija počiva na ideji da je moguće pacijenta snabdjeti nedostajućim genom ili zamjenom oštećenog. Pacijentovim leukocitima je u kulturi ex vivo, dodan gen za korekciju nedostajuće funkcije oštećenog gena, a zatim su ponovo vraćeni u njegov organizam. Zabilježeno je da tako uneseni gen (ADA) još uvijek funkcionira.

Ovaj model genske terapije je primijenjen i u tretmanu AIDS–a, kancera, cistične fibroze, hiperholesterolemije i drugih bolesti. Iako u nekim slučajevima ćelije pacijenta nisu prihvatile adekvatan broj aktivnih manipuliranih gena, razvojem dostatne procedure, genska terapija ex vivo bi uskoro mogla spašavati živote miliona ljudi.

Ostali pristupi genske terapije ex vivo također se koriste imunološkim reakcijama za uništenje tumora. Jedna podrazumijeva prenos antisens gen faktora rasta IGF–1. Nakon in vivo reimplantacije transformiranih tumorskih ćelija sa ovim genom dolazi do indukcije imunog odgovora, koji vodi uništenju nemodificiranih tumora po još nedovoljno poznatoj etiologiji. Drugi pristup se zasniva na unosu stimulatora, tj. sekvenci koje su normalno zastupljene u genomu, a koje su obavezne za početak punog djelovanja T–limfocita.^[4]

Genska terapija kancera obuhvata mnoštvo različitih pristupa. Za razliku od genske terapije nasljednih poremećaja, koja nije imala bogatija iskustva, ovaj terapijski pristup u liječenju raka se sve češće primjenjuje, ali još uvijek najčešće na nivou eksperimentalnog liječenja. Najčešći primjeri raka koji se liječe genskom terapijom su tumori mozga, rak dojke, debelog crijeva, maligni melanomi, mijelogenska leukemija, neuroblastomi, mikrocelularni i nemikrocelularni rak pluća, rak jajnika te razni čvrsti tumori.

Činjenica je da se genska terapija češće koristi kod liječenja raka, nego nekih drugih oboljenja. Ovo istovremeno svjedoči o njihovoj smrtnosti i ogromnim novčanim sredstvima koja se ulažu u istraživanju ovog medicinskog područja. Tome se pridružuje i relativno jednostaviji pristup u uništavanju ciljanih malignih stanica, vještački ili osposobljavanjem imunog sistema za samoodbranu organizma. U nekoliko najpoznatijih slučajeva primjene genske terapije ciljani su pojedinačni geni kao što su TP53. Augmentacijska terapija i djelovanje antisens KRAS gena se primjenjuje u nekim slučajevima mikrocelularnog raka pluća. U najvećem broju slučajeva, pristupa se ciljanom uništavanju ćelija raka, bez prethodnog poznavanja njegove molekularne etiologije.

Strategija genske terapije raka se u principu paralelno razvija u dva glavna pravca.

• Strategija ograničavanja veličine tumora je motivirana činjenicom da brojni oblici genske, kao ni bilo koje druge terapije raka, ne dovode do potpunog uništenja ciljanih tumorskih ćelija, razlikujući ih od zdravog tkiva. Naprimjer, genska terapija direktnog genskog prijenosa u tumorske stanice ne osigurava potpunu (100%) uspješnost kao ni bilo koji drugi vid promjene ćelija. Zbog toga je ovaj pristup u suštini rafiniranje klasičnog načina liječenja raka (konvencionalne terapije i hirurškog uklanjanja), a ne novi, zasebni oblik liječenja.

• Strategija uklanjanja tumora teži ka potpunom uništavanju ćelija raka. Ako se, na primjer, imuno–ćelije uspiju stimulirati na posebni imuni odgovor, onda je moguće govoriti o potpunom izliječenju. Bez obzira na primijenjenu terapiju, potpuno uklanjanje ćelija raka je prava rijetkost, jer se njegove ćelije ubrzano umnožavaju, uz selektivno preživljavanje onih najotpornijih. One se kasnije dijele i postaju potpuno otporne na propisanu terapiju.

Genska imunoterapija infektivnih oboljenja ima nešto drugačiji pristup u odnosu na onu kod liječenja raka. Zajedničko im je to da izazivaju specifični imuni odgovor, koji u slučaju infektivnih oboljenja, inhibira ćelijski ciklus infektivnog agensa, onemogućavajući tako širenje infekcije. Neki infektivni agensi su genetički stabilniji, dok se drugi brzo razvijaju u otporne sojeve i otežavaju opći pristup u liječenju. Jedan od najboljih primjera ovakvog infektivnog agensa je HIV–1, dobro poznati uzročnik AIDS–a koji ima visoku stopu mutacija i brzu evoluciju.

Genetička promjena limfocita u ex vivo genskoj terapiji raka, u jednom od svojih ishodišnih protokola, zasniva se na ciljanom uništavanju tumora stranim proteinom. Ovakva terapija se smatra vidom prilagodbene imunoterapije, budući da se gen za citokin – faktor nekroze tumora (TNF) unosi u tumor–filtrirajuće limfocite (TILs) i pospješuje njihovu antitumorsku efikasnost. TIL limfociti su, ustvari, normalno prisutni T–limfociti koji imaju sposobnost da prepoznaju i filtriraju tumorske depozite kao što su metastaze melanoma. T–ćelije proizvode TNF protein koji, ubrizgan u dovoljnim količinama u laboratorijskog miša, dovodi do uništavanja tumora. U čistom stanju, TNF je toksična materija, pa nakon direktnog ubrizgavanja u organizam čovjeka uzrokuje brojne negativne nuspojave. Zato se alternativno pristupa direktnoj primjeni TIL–ova u tumor kao svojevrsnih prenosilaca antitumorskog proteina). Cijela postavka zasniva se na tome da nakon ubrizgavanja izmijenjenih TIL–limfocita, koji nose gen za antitumorski protein, dolazi do uključivanja u rad lokalnih TIL–limfocita i proizvodnje antitumorskog proteina, te shodno tome i smanjenje tumora. Ipak, ispostavilo se da je efikasnost ove terapije dosta niska, a da ograničavajući faktori jesu (ne)uspješnost transformacije TIL–limfocita i down–regulacija primjene gena za antitumorski protein.

Prilagodbena imunoterapija genetičkom promjenom tumorskih ćelija je zasnovana na rezultatima laboratorijskih istraživanja genetički izmijenjenih tumorskih ćelija eksperimentalnih životinja. Dokazano je da izmijenjene ćelije sa unošenjem kodirajućeg gena za različite vrste citokina (interleukine, TNF, interferone itd.), ponovnim ubrizgavanjem u miša, otvaraju nove mogućnosti genske terapije. U svakom slučaju, genetički promijenjene ćelije tumora ili više ne rastu ili u početku rastu a zatim se raspadaju. Pored toga, presađivanje neizmijenjenih tumora dovodi do sistemskog imunog odgovora miševa na neizmijenjene tumore. Ovaj pristup je pokazao manju efikasnost kad se eksperimentiralo na većim i već nastalim tumorima. Ipak, mijenjanje strukture tumora i njihovo korištenje kao svojevrsnih antitumorskih vakcina (unošenja vlastitog imunog odgovora na posebne pojave tumore) i dalje je predmet intenzivnog istraživanja u liječenju raka.

Uvođenje posebnih gena retrovirusnom izmjenom tumora (kao što su određeni HLA antigeni), također je usmjereno ka unošenju (indukciji) imunog odgovora na tumor. Retrovirus–posredovanim ubrizgavanjem gena za HLA–57 antigen u tumor kod osoba koji ne posjeduju HLA–57 antigen, dovodi do unošenja imunog odgovora prema HLA–57 proteinu. Ciljani imuni odgovor onda biva usmjeren na tumor koji proizvodi strani antigen. Kasnije se stečeni imunitet može aktivirati u slučajevima kada se javlja ista vrsta tumora, čak i ako ne proizvodi strani antigen (HLA–57).

Adaptivna imunoterapija genetičkom izmjenom fibroblasta je razvijena na temelju iskustava da je otežana kultivacija tumorskih ćelija in vitro jedan od delikatnijih problema u ex vivo terapiji tumorskih oboljenja. U dugotrajnoj kulturi tumora opstaje manje od 50% ćelija. Kao zamjena za tumorske ćelije najčešće se koriste fibroblasti. Unošenjem gena za citokine IL–2 i IL–4 u genom fibroblasta kože stvara se osnova za klinička istraživanja raka dojke, kolorektalnog kancera, melanoma i karcinoma renalnih ćelija. Izmijenjeni fibroblasti (sa kapacitetom sinteze citokina) se ubrizgavaju subkutano u smjesi sa ozračenim autolognim tumorskim ćelijama. Očekuje se da će lokalna proizvodnja citokina u transgenima unijeti imuni odgovor usmjeren i na okolne, ozračene tumorske ćelije, odnosno razviti sistemski antitumorski imuni odgovor.

Brojne su tehnike promjene koje za cilj imaju promjenu tumorskih stanica in vivo. Najčešće je u upotrebi adaptivna imunoterapija kad se u čvrste tumore direktno ubrizgavaju izmijenjeni liposomi koji sadrže gene za HLA–B7. Tumorske ćelije fagocitiraju liposome i eksprimiraju strane antigene. U nekim slučajevima primjenjuje se retroviralna promjena tumora sa proterapeutikom, koji slabi tumorske ćelije i izlaže ih uništenju nakon primjene glavnog terapeutika. Jedan od krunskih primjera uspješnosti genske terapije in vivo koji je uspio uravnotežiti neophodne uslove preciznosti i specifičnosti djelovanja jeste direktna imunoterapija multiformnog glioblastoma putem ćelija fibroblasta, koje proizvode retroviralne faktore. Oni opet, ciljano djeluju samo na ćelije u fazi dijeljenja (tumorske), ali ne i na već prepoznate zdrave ćelije (okolne ćelije mozga).

Posebne nade u mogućnost transplantacije probudile su uspješne genetičko–inženjerske manipulacije organima nekoliko životinjskih vrsta.

Ksenotransplantacija, prema općoj definiciji, u medicinskoj primjeni podrazumijeva presađivanje životinjskih (umjesto ljudskih) tkiva i organa u organizam ugroženih pacijenata. Tako je moguće transplantirati srce, pluća, jetru, bubrege, pankreas i druge organe, iz dva osnovna razloga.

• Prva varijanta je razvijena za potrebe zaštite donorskih organa tokom nekoliko sati.
• Druga varijanta je u funkciji sprčavanja odbacivanja transplantata primjenom imunodepresivnih lijekova.

Sve su češći prijedlozi naučnika za razvoj protokola transplantacije organa životinjskog porijekla. Obično se mislilo da bi ne–hominidni primati, a osobito šimpanze ili babuni, mogli biti imunološki najprikladniji kao izvor organa za ovakve zahvate. Međutim, majmuni se sporo razmnožavaju i teško mogu podmiriti potencijalne potrebe za traženim organima. Pored toga, postoje i izvjesne poteškoće u procesuiranju njihovog kloniranja. Nasuprot tome, kultivirano stočarstvo već tradicionalno uključuje svinje i ostale domaće životinje kao izvor mesne hrane, a neke od njih su veoma plodonosne. Tako, ženka svinje može godišnje imati po dva okota sa po (prosječno) desetak mladunaca.

Jedan od mogućih oblika primjene ove tehnologije je i terapeutsko kloniranje organa i tkiva za transplantaciju. Taj proces se zasniva na izdvajanju DNK individue kojoj je potrebna transplatacija. Izoliriana DNK se zatim ubacuje u denukleiranu jajnu ćeliju. Nakon što se dokaže da takva jajna ćelija sadrži pacijentovu DNK, inaktivira se mitoza, da bi se embrionalne stem ćelije mogle upotrijebiti za stvaranje odgovarajućih tkiva i organa. Takve tranplantate je moguće prenijeti u pacijenta bez rizika od odbacivanja. Podrazumijeva se da je primjena ovakvog postupka moguća tek nakon savladavanja mnogih imunoloških, metodološko–aplikacijskih, tehničkih i drugih prepreka.

Transgene životinje se proizvode tako što se:

• direktno u jajnu ćeliju ubaci manipulirani gen

ili se

• jajna ćelija primaoca denukleira in vitro, a zatim se u nju ugrađuje genetički izmijenjeno donor–jedro (sa objedinjenim genom za kodiranje poželjnog proteina).

Tako izmijenjena jajna ćelija (zigot) se unosi u uterus majke – primaoca (ili surogat – majke). Nakon normalnog razvoja izmijenjenog zigota rađaju se genetički izmijenjene jedinke. Primjenom opisane procedure oni se zatim mogu klonirati u praktično beskonačno mnogo kopija.

Razumljivo je da ljudski organizam odbacuje ugrađene svinjske organe. Genetičko inženjerstvo, međutim, može omogućiti da takvi transplantati izgube izvornu antigenost. Tako su već proizvedeni sojevi genetički izmijenjenih svinja čiji organi u ljudskom organizmu mogu opstati i po nekoliko mjeseci. Oni se mogu upotrijebiti za premoštavanje vremenske distance između odluke za transplantaciju i pribavljanja odgovarajućeg ljudskog izvora organa – transplantata. Od svih uspješno kloniranih životinja, svinje imaju najveću “sličnost” sa tkivima i organima čovjeka. Da bi uopće postojala mogućnost tranplantacije svinjskih organa i tkiva u organizam čovjeka potrebno je izvršiti inaktivaciju gena (knock–out) koji kodiraju proizvodnju proteina koji izazivaju imunološku reakciju čovjeka. Proces inaktivacije se vrši u jednoj individualnoj ćeliji koja se koristi za proizvodnju odgovarajućih organa. Dvostruka inaktivacija (double knock–out) gena svinje podrazumijeva genetičku manipulaciju u cilju ukidanja djelovanja obje homologne kopije gena odgovornih za odbacivanje transplatata. Tako je, između ostalog, i proizvodnja transgenih svinjskih organa koji su široko prihvatljivi pacijentima krvne grupe 0 (univerzalnim davaocima – bez glavnih antigena ABO sistema) jedan od hitnih ciljeva u ovoj oblasti.

"Genske farme", "gensko farmerstvo", "uzgoj gena" (i tome slično) su među novijim nazivima u rijčniku biotehnologije zasnovanih na genetičkom inženjerstvu. Ovakve farme su već zasnovane u mnogim biotehnološkim kompanijama razvijenog svijeta. Geni koji kodiraju biosintezu dijagnostički i terapeutski zanimljivih proteina su uključeni u molekule životinjske DNK, a poželjne – namjenske supstance se luče u životinjskom mlijeku. Proizvedene su i transgene biljke, koje sintetiziraju lijekove za tretman cistične fibroze, kancera, krvnih bolesti i drugih teških poremećaja. Antitrombin III (za sprečavanje zgrušavanja krvi tokom hirurških operacija) se već dobija iz mlijeka genetički izmijenjenih koza, a klinička ispitivanja proizvoda te biotehnologije su u toku.^[1] Savremena istraživanja mogućnosti genetičke konstrukcije i kloniranja genetički izmijenjenih sisara uglavnogm su usmjerena ka ugradnji onih gena čiji se proizvodi ne luče u mlijeku, nego u urinu (kod visokoreproducibilnih miševa, npr.). Motivi takvih ambicija su, prije svega, praktične naravi: ekskrecija urina je stalna fiziološka funkcija svih životinja, a mlijeko luče samo ženke – periodično, u toku laktacije.

Počeci kloniranja životinja nisu novijeg datuma, jer su prvi takvi pokušaji zabilježeni još 1952. godine. Razvoj genskog farmerstva bio je snažno stimuliran pojavom prve (sada već bivše!) transgene ovce (poznate pod imenom Dolly, 1997.) i kloniranih miševa (1998.). Ubrzo nakon toga, klonirana je i ovca (Polly) sa ugrađenim ljudskim genom za kodiranje sinteze terapeutskog proteina, koji se luči u mlijeku. Do danas je kloniran veliki broj individua različitih vrsta životinja uključujuć ovce, goveda, koze, miševe, svinje, mačke, zečeve itd. Prvi transgeni nehominidni primat bio je rezus majmun (2001.), zvani ANDi (po inverziji skraćenice DNA), u kojeg je unešen marker–gen meduze za fluorescentni protein (GFP). Taj uspjeh se smatra jednim od najuvjerljivijih dokaza mogućnosti široke primjene genske terapije u medicini.^[1]

Genska terapija je jedno od najprivlačnijih područja razvoja, kako novih biotehnologija, tako i načina liječenja pacijenata od mnogih opakih bolesti. Njen razvoj je potaknut liječenjem bolesti koje slabo ili nikako ne reagiraju na klasične lijekove i tretmane.

Uočeno je preko 4.000 nasljednih oboljenja, a genskom terapijom su liječeni: SCID, cistična fibroza, Gausher oboljenje, familijarna hiperholesterolemija, hemofilija, nedostatak alfa 1 antitripsina, Fanconi anemija, Hunter sindrom, hronično granulomatozno oboljenje, reumatoidni artritis i periferno vaskularno oboljenje. Najveći broj njih je izazvan nedostatkom jednog genskog proizvoda ili se javlja usljed nastanka mutiranog gena koji nije u stanju da obavlja svoju originalnu funkciju. Pristup genske terapije u ovom slučaju je vrlo jednostavan. Pacijentu se može pomoći samo ubrizgavanjem zdrave kopije gena. Međutim, taj jednostavni koncept ne navodi na mogućnost da se ovakvi protokoli mogu uspješno primijeniti i na pacijenta.

Problemi u napretku takvih tehnologija se vežu za činjenicu da je broj genetičkih oboljenja za koja je identificiran odgovarajući gen odgovoran za bolest, u suštini mali. Problem je i pojava da se niti jedan od vektorskih sistema za isporuku gena nije pokazao kompletno uspješnim. Neka nasljedna oboljenja se odlikuju kompleksnošću jer se efekti nedostatka gena manifestiraju u više organa, tj. tkiva. Zato je ciljani gen teško ubaciti u aficirane ćelije. Regulacija nivoa ekspresije se također pokazala problematičnom. I konačno, pitanje atraktivnosti obrade pacijenata na ovaj način je također diskutabilno, zato što se farmaceutske kuće više bave tretmanom oboljenja poput kancera koja su moderna oboljenja današnjice, a broj pacijenata koji imaju genetička oboljenja, u poređenju sa ovim prvim, relativno je mali.

U početnoj fazi ispitivanja ovih oboljenja, naučnici su se usredsredili na hemoglobinopatije. One su davno bile okarakterizirane na molekulskoj razini, kada je uočeno da se njihovo otkrivanje svodi na analizu α– i β–lanaca hemoglobina. Ovom u prilog je išla i činjenica da se ciljane ćelije koštane srži mogu (relativno lahko) ukloniti i zamijeniti. Kod hemoglobinopatija, međutim, sinteza odgovarajućih grupa funkcionalnog hemoglobina je ovisna o prisustvu α– i β–gena sa ispravnom sekvencom aminokiselina, ali također i sa detaljnom regulacijom genske ekspresije. Tako čvrsta regulacija ekspresije unešenih gena je iznad kapaciteta tehnologije genske terapije.

Drugo oboljenje koje se pokušalo tretirati genskom terapijom je bila SCID (ozbiljni kombiniranai nedostatak imuniteta). Praćena je nedostatkom adenozin–dezaminaze (ADA'). To je rijetka genopatiju koja se ispoljava kao vrlo ozbiljni nedostatak imuniteta kod djece. Enzim ima važnu ulogu u razgradnji purinskih nukleotida i katalizira izdvajanje amonijaka iz adenozina, pri čemu se stvara inozin koji se obično prevodi u mokraćnu kiselinu. Ovo vodi ka disfunkciji T i B limfocita. Nedostatak efektivnog imunološkog sistema znači da oboljeli od SCIDa moraju uslovno biti u sterilnom ambijentu. Kada se ovaj tretman uporedi sa onim kod talasemija, regulacija ekspresije ADA je izgleda manje važna za terapeutski ishod. Kod najvećeg broja metaboličkih oboljenja izazvanih enzimskim nedostatkom, čak je ekspresija i male frakcije enzima dovoljna za poboljšanje simptoma bolesti. Tako je 1990. godine funkcionalni ADA–gen bio ubačen u nukleusni materijal. Genski korigirani autologni T–limfociti su bili ubrizgani dvjema djevojkama koje pate od ovog oboljenja. Jedna pacijentica je primila 11 infuzija i od tada ta djevojčica živi, u biti, normalnim životom. I ona, kao i druga djevojčica, nastavile su primati polietilen glikola. U svojoj cirkulaciji obje imaju T–limfocite dobijene genetičkim injženjerstvom. Terapija se u oba ova slučaja pokazala uspješnom, jer su se imunološke funkcije kod pacijenata poboljšale, ali je terapija tekla sa PEG (polietilen-glikol) i ADA lijekom koji je također uspješan u terapiji.

Gen za cističnu fibrozu je identificiran 1989. godine. On kodira 170–kD–protein, tzv. transmembranski regulator provodljivosti cistične fibroze, koji u epitelnim ćelijama djeluje kao hloridni kanal. Nasljeđivanje mutantnog cftr gena od oba roditelja se ispoljava kao CF fenotip, pri čemu 5%–10% ciljane populacije mora ima ekspresiju CFTR gena. Za isporuku CF gena u epitel pacijenata koristi se nekoliko vektora. Najčešći sistemi su adenovirusi i kationski liposomi. Prijenos vektora u ciljane ćelije se može ostvariti i tehnologijom aerosola. Isporuka CFTR–a je demonstrirana sa oba vektorska tipa.

• Prve bolesti koje su liječene genskom terapijom

Kancer*

SCID**

Cistična fibroza

Gaucherova bolest

Familijarna hiperholesterolemija

Hemofilija

Deficijencija purinnukleozid–fosforilaze

Alfa–1 antitripsin nedostatak

Fanconijeva anemija

Hunterov sindrom

Hronična granulomatozna bolest

Reumatoidni artritis

Periferna vaskularna bolest

AIDS

- * Melanom, neuroblastom, malignomi mozga, glave i vrata, pluća, jetre, bubrega, rak jajnika, rak dojke, kolona, prostate, mezoteliom, leukemija, limfom, višestruki mijelom.
- ** SCID = Severe Combined Immunodeficiency – kombinirani imunološki nedostatak.

Uz sve navedene prednosti kloniranja i genske terapije, postoje i brojni (stvarni ili hipotetski) rizici primjene navedenih biotehnologija. Reproduktivno kloniranje je skupo i relativno neefikasno. Tako se kod više od 90% pokušaja kloniranja ne proizvoda promjenljivi potomci, a za nastanak jednog klona potrebno je više od 100 transnuklearnih operacija. Također je uočeno da su kod kloniranih životinja česte pojave potiskivanja imunološke funkcije, uz visoku stopu infekcija, kancera i drugih bolesti. Zabilježeno je da takve životinje umiru ranije nego što je prosječni vijek vrste kojoj pripadaju. Budući da se u procesu kloniranja umnožavaju obilježja samo jedne individue, takav genetički otisak može dovesti i do razvoja abnormalnosti kloniranih embriona.

Mnogi stručnjaci upozoravaju i na mogućnost uključivanja ebola ili MSC virusa ("kravljeg ludila") u ljudski genom i pojave drugih pandemija. Istovremeno, u jednoj od prihvatljivijih hipoteza, naučnici vjeruju da je HIV u genom ljudske vrste unesen konzumacijom majmunskog mesa. Argumentacija da je takva opasnost izbjegnuta u slučaju prehrane svinjskim mesom i njegovim prerađevinama, traži se u činjenici da je ono u ljudski jelovnik uvršteno još prije 10–12 milenija (u bliskoistočnom i kineskom području domestikacije), a bez registriranih masovnih i ozbiljnijih infekcija takve prirode.^[4]

• Genetičko testiranje
• Genetička konsultacija
• Genetička identifikacija
• Genetička analiza

• Gene Therapy: Molecular Bandage? University of Utah's Genetic Science Learning Center
• The American Society of Gene & Cell Therapy Arhivirano 29. 11. 2009. na Wayback Machine
• The European Society of Gene & Cell Therapy
• Research Group at Cambridge, UK working on overcoming current hurdles to successful gene therapy
• Council for Responsible Genetics
• Molecular Medicine and Gene Therapy at Lund University
• Gene Therapy Frees β-Thalassemia Patient From Transfusions
• Clinical Trial at Sloan Kettering
• Stem Cell Therapy Trial Offers Hope