Kupplungsreagenz

Ein Kupplungsreagenz (auch Kopplungsreagenz)^[1][2] wird in der Peptidsynthese, der Vernetzung, der Immobilisierung und der Molekülmarkierung verwendet, um Reaktionen an Aminosäuren durchzuführen.

Aminosäuren kondensieren nur langsam miteinander, sowohl bei einer Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren als auch bei einer Bindung von einer Aminosäure an eine Modifikation wie eine Markierung. Durch die Verwendung eines Kopplungsreagenz wird eine der beteiligten Aminosäuren am C-Terminus vorübergehend in eine reaktive Zwischenstufe überführt, die anschließend bereitwillig mit einem Nukleophil reagiert (der N-Terminus und weitere Aminogruppen sowie Sulfhydrylgruppen müssen zur Vermeidung unerwünschter Reaktionen bei der Peptidsynthese mit Schutzgruppen blockiert sein), oder die Kopplung erfolgt dauerhaft, z. B. bei einem Vernetzer oder einer Markierung. Eine Racemisierung kann durch Ionisierung des Wasserstoffatoms am α-C-Atom der C-terminalen Aminosäure und Bildung eines Oxazolinon-^[3] oder eines Enol-Übergangszustands entstehen. Daher werden oftmals zur Minderung der Racemisierung Additive wie Hydroxybenzotriazole oder zunehmend aufgrund der fehlenden Explosionsgefahr Oxyma zugesetzt. Zieleigenschaften bei der Entwicklung von Kupplungsreagenzien sind primär Ausbeute, geringe Epimerisierung und Nebenreaktionen, sekundär die Reaktionsrate.^[4] Es existiert eine Vielzahl an Kupplungsreagenzien,^[3][4] da nicht jede Kombination zweier Aminosäuren mit einem Kupplungsreagenz die gleiche Ausbeute aufweist. Wasserlösliche Kupplungsreagenzien können zur Immobilisierung und zur Vernetzung von Peptiden in wässrigen Lösungen verwendet werden. Kupplungsreagenzien können in verschiedene Stoffklassen unterteilt werden.^[3]

Beispiele für Kopplungreagenzien der Carbodiimide sind Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC). Wasserlösliche Carbodiimid-Kupplungsreagenzien sind EDC (meist als Hydrochlorid) und CMC. Meistens wird zur Minderung einer Racemisierung Hydroxybenzotriazol (HOBt),^[5] 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt)^[6] oder Hydroxyiminocyanessigsäureethylester (Oxyma) verwendet. Zur Kupplung an Hydroxidgruppen wird 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP) in katalytischen Mengen verwendet (0,15-faches stöchiometrisches Verhältnis). Als Nebenreaktion kann es zu einer Dehydratisierung von Asparagin und Glutamin kommen.

Phosphoniumsalze neigen weniger zur Racemisierung und zur Dehydratisierung von Asparagin und Glutamin als Carbodiimide, z. B. BOP-Reagenz,^[7][8] PyBOP,^[9] PyBrOP^[10] und PyOxim. BOP erzeugt als Nebenprodukt das karzinogene Hexamethylphosphoramid. PyOxim ist gleichzeitig ein Oxyma-Derivat.

Immoniumsalze in der Peptidsynthese sind z. B. BOMI, BDMP, in geringerem Umfang werden auch AOMP, FOMP, DOMP, BPMP, und SOMP verwendet.^[3]

Aminiumsalze (ursprünglich irrtümlich als Uroniumsalze beschrieben)^[11] umfassen z. B. HBTU,^[12] TBTU, HATU,^[13] HCTU,^[14] TATU. Meistens wird zur Minderung der Racemisierung HOBt hinzugefügt.

Uroniumsalze in der Peptidsynthese sind z. B. TNTU, TPTU, TOTU, TDBTU, COMU,^[15] COMBU^[16] und TOMBU.^[16] TSTU ist wasserlöslich. COMU, COMBU und TOMBU sind gleichzeitig Oxyma-Derivate.

Als Kupplungsreagenzien werden z. B. CBMIT, BOI, CIP, CIB, CMBI verwendet.^[3]

Weitere Kupplungsreagenzien in der Peptidsynthese sind DEPBT, CDI und TCFH.

N-Hydroxysuccinimid-, Hydroxysulfosuccinimid- und andere Succinimidylester reagieren mit der Aminogruppe einer Aminosäure.

Phenylisothiocyanat (PITC) und andere Isothiocyanate werden unter anderem beim Edman-Abbau verwendet. Fluoreszente Derivate sind FITC und TRITC, während DABITC zu farbigen Kopplungsprodukten führt. Ein flüchtiges Kopplungsreagenz ist Trifluorethylisothiocyanat (TFEITC).^[17] Phenyldiisothiocyanat wird zur Vernetzung zweier Aminogruppen verwendet.

Weiterhin werden Bisoxirane, Bromcyan, Divinylsulfon, Epichlorhydrin, Glutaraldehyd, Periodsäure oder Trichlor-s-triazin verwendet.^[1]

1. ↑ ^{a b} Martin Holtzhauer: Biochemische Labormethoden. Springer-Verlag, 2013, ISBN 978-3-642-97111-2, S. 88.
2. ↑ Martin Holtzhauer: Biochemische Labormethoden. Springer-Verlag, 2013, ISBN 978-3-642-97609-4, S. 120.
3. ↑ ^{a b c d e} So-Yeop Han, Young-Ah Kim: Recent development of peptide coupling reagents in organic synthesis. In: Tetrahedron. 60, 2004, S. 2447, doi:10.1016/j.tet.2004.01.020.
4. ↑ ^{a b} E. Valeur, M. Bradley: Amide bond formation: beyond the myth of coupling reagents. In: Chemical Society reviews. Band 38, Nummer 2, Februar 2009, S. 606–631, doi:10.1039/b701677h, PMID 19169468.
5. ↑ Wolfgang König, Rolf Geiger: Eine neue Methode zur Synthese von Peptiden: Aktivierung der Carboxylgruppe mit Dicyclohexylcarbodiimid unter Zusatz von 1-Hydroxy-benzotriazolen. In: Chemische Berichte. 103, 1970, S. 788, doi:10.1002/cber.19701030319.
6. ↑ J. Klose, A. El-Faham, P. Henklein, L.A. Carpino, M. Bienert: Addition of HOAt dramatically improves the effectiveness of pentafluorophenyl-based coupling reagents. In: Tetrahedron Letters. 40, 1999, S. 2045, doi:10.1016/S0040-4039(99)00089-1.
7. ↑ R. Seyer, A. Aumelas, A. Caraty, P. Rivaille, B. Castro: Repetitive BOP coupling (REBOP) in solid phase peptide synthesis. Luliberin synthesis as model. In: International journal of peptide and protein research. Band 35, Nummer 5, Mai 1990, S. 465–472, PMID 2198236.
8. ↑ A. Nagy, B. Szoke, A. V. Schally: Selective coupling of methotrexate to peptide hormone carriers through a gamma-carboxamide linkage of its glutamic acid moiety: benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate activation in salt coupling. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 90, Nummer 13, Juli 1993, S. 6373–6376, PMID 8101004. PMC 46931 (freier Volltext).
9. ↑ J. Coste, D. Le-Nguyen, B. Castro: PyBOP: A new peptide coupling reagent devoid of toxic by-product. In: Tetrahedron Letters. 31, 1990, S. 205, doi:10.1016/S0040-4039(00)94371-5.
10. ↑ Jacques Coste, Eric Frérot, Patrick Jouin, Bertrand Castro: Oxybenzotriazole free peptide coupling reagents for N-methylated amino acids. In: Tetrahedron Letters. 32, 1991, S. 1967, doi:10.1016/0040-4039(91)85015-W.
11. ↑ Iman Abdelmoty, Fernando Albericio, Louis A. Carpino, Bruce M. Foxman, Steven A. Kates: Structural studies of reagents for peptide bond formation: Crystal and molecular structures of HBTU and HATU. In: Letters in Peptide Science. 1, 1994, S. 57, doi:10.1007/BF00126274.
12. ↑ Reinhard Knorr, Arnold Trzeciak, Willi Bannwarth, Dieter Gillessen: New coupling reagents in peptide chemistry. In: Tetrahedron Letters. 30, 1989, S. 1927, doi:10.1016/S0040-4039(00)99616-3.
13. ↑ L. P. Miranda, P. F. Alewood: Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 96, Nummer 4, Februar 1999, S. 1181–1186, PMID 9989998. PMC 15437 (freier Volltext).
14. ↑ C. A. Chantell, M. A. Onaiyekan, M. Menakuru: Fast conventional Fmoc solid-phase peptide synthesis: a comparative study of different activators. In: Journal of Peptide Science. Band 18, Nummer 2, Februar 2012, S. 88–91, doi:10.1002/psc.1419, PMID 22147296.
15. ↑ C. U. Hjørringgaard, A. Brust, P. F. Alewood: Evaluation of COMU as a coupling reagent for in situ neutralization Boc solid phase peptide synthesis. In: Journal of Peptide Science. Band 18, Nummer 3, März 2012, ISSN 1099-1387, S. 199–207, doi:10.1002/psc.1438, PMID 22252935.
16. ↑ ^{a b} Y. E. Jad, S. N. Khattab, B. G. de la Torre, T. Govender, H. G. Kruger, A. El-Faham, F. Albericio: TOMBU and COMBU as Novel Uronium-type peptide coupling reagents derived from Oxyma-B. In: Molecules. Band 19, Nummer 11, 2014, S. 18953–18965, doi:10.3390/molecules191118953, PMID 25412042.
17. ↑ Hubert Rehm: Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics. Springer-Verlag, 2016, ISBN 978-3-662-48851-5, S. 312.